碘化丙啶（Propidium Iodide， 简称PI）是一种在生命科学研讨中不可或缺的经典核酸荧光染料。
碘化丙啶（Propidium Iodide， 简称PI）是一种在生命科学研讨中不可或缺的经典核酸荧光染料。因其共同的膜通透性原理和明显的荧光增强效应，它已成为细胞生机检测、细胞周期剖析和细胞凋亡研讨等范畴的要害东西。本文将系统阐述碘化丙啶的界说、作业原理、中心运用场景及试验中的要害考量，为您供给一份全面的技能参阅。
碘化丙啶是一种具有双锭环结构的阳离子荧光染料，其化学式为C₂₇H₃₄I₂N₄，分子量为668.39。在常温常压下性质安稳，通常以深赤色结晶性粉末办法存在，需在2-8°C条件下避光保存。
从功能上看，PI被归类为“膜不通透性”染料。这是其一切运用规划的柱石：它无法穿过完好、健康的细胞质膜。只有当细胞膜因坏死、晚期凋亡或物理化学损害而失掉完好性时，PI才干进入细胞。
1. 选择性染色机制：根据细胞膜完好性进行区别。活细胞和前期凋亡细胞的膜是完好的，因而将PI排挤在外；而死细胞或膜严峻受损的细胞则答应PI自在进入，并与细胞内的核酸结合。这一特性使其成为判别细胞死活的“金规范”探针之一。
2. 荧光产生与增强机制：PI自身荧光很弱。当其经过嵌入办法与细胞内的双链DNA（或RNA）结合后，其荧光强度会急剧增强20至30倍。一起，其光谱特性会产生改动：游离状况：最大激起/发射波长约为493 nm / 636 nm。结合核酸后：最大激起峰红移至约535 nm，发射峰蓝移至约617 nm（处于赤色荧光规模）。这一明晰的红移信号易于被流式细胞仪或荧光显微镜的相应通道（常用PE或PerCP通道）检测，且易于与其他荧光染料区别。
这是PI最经典的运用。经过简略的染色，可在流式细胞仪或荧光显微镜下快速区别并定量集体中的死细胞份额。该办法常用于评价药物毒性、基因修改作用、细胞别离纯化后的存活率以及免疫细胞杀伤（如CTL、NK细胞）试验等。
要害试验：在检测γδ T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤活性时，常用Calcein-AM符号靶细胞（活细胞发绿色荧光），与效应细胞共孵育后，参加PI。被杀伤的靶细胞膜破损，被PI染上赤色荧光，经过流式细胞术即可准确定量细胞毒活性。
PI能够与细胞内的悉数DNA（包含基因组DNA和RNA）结合。在经过预处理（如用核糖核酸酶I完全消化RNA，并用去垢剂如Triton X-100通透细胞膜）后，PI的染色量与DNA含量成正比。经过流式细胞术检测单个细胞的PI荧光强度，能够制作出DNA含量散布直方图，然后将细胞集体区别为G0/G1期、S期和G2/M期，用于研讨细胞增殖、周期阻滞或倍性剖析。
技能位置：PI单染法是当时流式细胞术进行细胞周期剖析最经典且大规模的运用的办法之一。
在细胞凋亡的多阶段过程中，前期凋亡细胞膜坚持完好（PI阴性），而进入晚期凋亡或产生继发性坏死的细胞，其膜完好性损失，变为PI阳性。因而，PI常与针对前期凋亡的符号物（如Annexin V， 用于检测膜外翻）联合运用，构成经典的Annexin V/PI双染法，然后在流式细胞术中将细胞区别为：活细胞（双阴性）、前期凋亡细胞（Annexin V单阳性）、晚期凋亡/坏死细胞（双阳性）。
在免疫荧光、荧光原位杂交（FISH）等试验中，需要对细胞核做定位。PI可作为核复染剂，对经固定和通透处理的细胞核进行赤色荧光符号，然后明晰勾勒出细胞概括，辅佐定位其他方针蛋白或核酸在细胞内的具置。
1. 样本制备：搜集细胞，用预冷的PBS洗刷。2. 固定与通透（仅限周期剖析或固定后染色）：常用70%乙醇于-20°C固定细胞。关于周期剖析，需用含RNase和去垢剂（如0.1% Triton X-100）的缓冲液处理。3. 染色：用PBS或专用染色缓冲液制造PI作业液（常用终浓度为1-50 µg/mL）。重悬细胞，避光孵育15-30分钟。4. 检测：赶快运用流式细胞仪（激起光常用488 nm， 搜集600 nm的发射光）或荧光显微镜进行检测。
PI的赤色荧光（~617 nm）与其他染料的光谱兼容性好，常用于多参数剖析。下表列举了常见的组合运用：
安全性：PI是一种已知的致骤变剂，具有生殖细胞致骤变危险（H341损害声明）。操作时有必要佩带手套、试验服和护目镜，在指定的区域进行。含有PI的废液需专门搜集，并经过活性炭吸附等无害化处理后再丢掉，切勿直接倒入下水道。
荧光淬灭：PI对光灵敏，一切染色和保存过程均应尽或许避光操作，以减缓荧光淬灭。
RNA搅扰：PI既能结合DNA也能结合RNA。在进行严厉的DNA含量剖析（如细胞周期）时，一定要运用不含DNA酶的核糖核酸酶（RNase）做处理，以消除RNA结合带来的布景搅扰。
浓度与孵育时刻优化：PI的染色作用受浓度、孵育时刻、细胞密度和固定办法影响。主张初度试验时设置梯度来优化，防止浓度过高导致非特异性布景或荧光猝灭。
碘化丙啶以其原理明晰、运用快捷、信号明晰和经济高效的长处，在根底科研到药物挑选的很多环节中占有了安定的位置。其中心价值在于对细胞膜完好性这一底子生命状况的准确陈述。跟着多色流式、高内在成像等技能的开展，PI作为死细胞指示剂和核染色的人物将变得更重要。
但是，研讨者也需意识到其局限性，例如无法区别晚期凋亡与原发性坏死，以及在某些固定条件下或许进入活细胞等。因而，在杂乱的生物学问题研讨中，将PI与其他能反映前期凋亡、代谢活性或特定通路状况的探针联合运用，方能取得更全面、深化的细胞生命信息。
